Audubon nació en Haití. Era el hijo ilegítimo de un capitán de navío francés y su amante. Creció en Francia junto con su madrastra. Audubon afirmó que en su más temprana educación recibió clases de Jacques Louis David, un pintor posteriormente famoso en la Francia revolucionaria, pero esta afirmación se ha descartado posteriormente junto con otras "ficciones" de Audubon.

En 1803, su padre le consiguió un pasaporte falso para viajar a los Estados Unidos y así evitar su llamamiento a filas en las Guerras Napoleónicas. Audubon cogió la fiebre amarilla y el capitán del barco lo alojó en una casa de huéspedes regentada por mujeres cuáqueras que cuidaron de él hasta que se repuso y le enseñaron la particular versión cuáquera del idioma inglés. En ese año conoció y comprometió con su vecina Lucy Bakewell, con la que se casaría en 1808.

Audubon supervisó una granja familiar cerca de Filadelfia y comenzó el estudio de la naturaleza realizando los primeros anillamientos del continente americano. Audubon ataba hilos a las patas de Sayornis phoebe y determinó que volvían a los mismo lugares de anidamiento año tras año.

Después de años de negocios exitosos en Pennsylvania y Kentucky, sufrió una bancarrota. Esto le obligó a esforzarse más en sus estudios de la naturaleza y en la pintura y navegó por el río Misisipi con su arma, sus pinturas y un asistente con la intención de encontrar y pintar todas las aves de América del Norte.

A su llegada a Nueva Orleans, Luisiana en la primavera de 1821 vivió durante un tiempo en el Barracks Street 706. Ese verano se mudó río arriba a la plantación Oakley en la Parroquia de West Feliciana para enseñar a pintar a Eliza Pirrie, la hija más joven de los propietarios, y allí paso una gran parte de su tiempo paseando y pintando en los bosques. (La plantación, situada en 11788 Highway 965 entre Jackson, Luisiana y St. Francisville, Luisiana, es en la actualidad el Audubon State Historic Site y es posible hacer visitas guiadas).

Para dibujar o pintar las aves, Audubon tenía que dispararles primero, realizando un disparo fino para evitar hacerlas pedazos. Entonces usaba alambres para mantenerlas derechas y conseguir una postura natural. Además representaba a las aves de forma natural en su propio ambiente. Esto suponía un gran contraste con las rígidas representaciones de sus contemporáneos, como Alexander Wilson. Audubon una vez escribió: Digo que hay pocas aves cuando mato menos de cien en un día. Uno de sus biógrafos, Duff Hart-Davis, revela, Cuanto más rara era el ave, con mayor impaciencia la perseguía Audubon, sin preocuparse aparentemente porque su muerte acercase un poco más a la especie a su extinción.

Puesto que no disponía de ingresos, vivía de vender retratos bajo demanda, mientras que su mujer, Lucy, trabajaba como tutora para las familias ricas de las plantaciones. Audubon buscó un editor para su obra en Filadelfia pero fracasó en parte porque se había granjeado la enemistad de varios de los principales científicos de la ciudad en la Academia de Ciencias Naturales.

Finalmente, en 1826 embarcó junto con su portafolio hacia Londres. Los británicos nunca tenían suficientes imágenes de los bosques de EE.UU. y tuvo un éxito instantáneo. Fue apodado el "The American Woodsman" y consiguió suficiente dinero para publicar su Birds of America. Esta obra consistía en láminas de tamaño natural grabadas y pintadas a mano. Incluso el rey Jorge IV se convirtió en un admirador de Audubon. Éste fue nombrado miembro de la Royal Society. En esto siguió los pasos de Benjamin Franklin, que había sido el primer miembro americano.

Mientras se encontraba en Edinburgo para buscar suscripciones para su libro, dio una demostración de su método de usar alambres para mantener a las aves muertas en la Wernerian Natural History Association del profesor Robert Jameson. Uno de los alumnos en la audiencia era Charles Darwin. Durante esta estancia también visitó al anatomista Robert Knox (no mucho antes de que Knox se asociara con Burke y Hare).

Audubon acompañó su libro "Birds of America" con Ornithological Biographies, que incluía información sobre cada especie. Este libro lo escribió junto con el ornitólogo escocés William MacGillivray. Tanto el libro de dibujos como las "biografías" fueron publicados entre 1827 y 1839.

En 1842 publicó una versión popular de Birds of America en Estados Unidos. Su obra final trataba sobre los mamíferos, Viviparous Quadrupeds of North America. Ésta fue completada por su hijo y su hijastro.

Aududon abrió una tienda de comestibles en Louisville, Kentucky, vivió en Henderson, Kentucky y fue testigo del terremoto de Nueva Madrid. Tuvo dos hijos: Victor Gifford (nacido el 12 de junio de 1809) y John Woodhouse (nacido el 30 de noviembre de 1812), y dos hijas: Lucy (1815 -1817) y Rose (1819).