Descifrando la naturaleza de los genes

Un hito importante en el camino que condujo a las pruebas genéticas fue el descubrimiento de la estructura del ácido desoxirribonucleico (ADN), la molécula que contiene los genes. Desde mediados del siglo XIX, cuando el monje Gregor Mendel llevó a cabo sus famosos experimentos sobre la reproducción de los guisantes, se sabía que características físicas tales como la estatura y el color se transmitían de una generación a otra a través de unidades hereditarias que posteriormente se denominaron genes. Pero el carácter físico del gen había evitado a los científicos hasta el año 1944, en que los estudios de Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty, del Instituto Rockefeller de Nueva York, proporcionaron la primera prueba experimental de que el ADN transmite la información genética. Demostraron que para transformar bacterias inofensivas en bacterias de un tipo que pueda causar neumonía sólo se necesitaba introducir en ellas ADN de una cepa que causara neumonía. Ese experimento sugirió que los genes estaban hechos de ADN e hizo que muchos investigadores comenzara la búsqueda para determinar la estructura exacta del ADN y desvelar cómo los genes ejercen su influencia en todos los seres vivos.

La estructura helicoidal regular del ADN permite que se separen los filamentos para realizar la copia, un mecanismo sencillo para transmitir información genética de una generación a la siguiente. (National Center for Human Genome Research, NIH [Centro Nacional de Investigaciones del Genoma Humano, NIH])

Dos de estos investigadores, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, del Kings College de Londres, estudiaron el patrón que se generaba cuando las fibras de ADN dispersaban rayos X. La imagen fotográfica reveló inmediatamente que la estructura de ADN era regular y helicoidal. Con esa información y el conocimiento de la química de los componentes del ADN, James Watson y Francis Crick, en aquella época en los laboratorios del Consejo de Investigaciones Médicas de Cambridge, Inglaterra, comenzaron a construir modelos moleculares que pudiesen explicar los detalles de la fotografía. El modelo que finalmente propusieron en 1953 contiene dos filamentos enrollados helicoidalmente y conectados entre sí mediante una serie de "peldaños" moleculares. Sugirieron que cada peldaño estaba formado por uno o dos "pares de bases" químicas llamados adenina (A)-timina (T) o guanina (G)-citosina (C). Estos jóvenes científicos supusieron correctamente que era el orden de esas bases de A, T, G y C del filamento de ADN el que determinaba detalladamente el legado genético de todo organismo vivo. También reconocieron que las dos cadenas se podrían separar para copiar, un mecanismo sencillo para transmitir información genética de una generación a la siguiente.

Unos años después que Watson y Crick explicaran la estructura del ADN, otros investigadores, entre los que destacan Marshall Nirenberg, en los Institutos Nacionales de Salud, y Har Gobind Khorana, en la Universidad de British Columbia, descifraron el código genético que utilizan todas las células vivas para traducir la serie de bases de su ADN en instrucciones para la producción de miles de proteínas que determinan la estructura de la célula y llevan a cabo todas sus funciones, entre las que se incluye la determinación de características genéticas como el color de los ojos y la susceptibilidad al cáncer. Los investigadores descubrieron que cada triplete de bases (por ejemplo, CTG) codifica un aminoácido (en este caso la leucina) o una señal para comenzar o detener el desarrollo de la cadena larga de aminoácidos que crean una proteína.

Los errores genéticos provocan enfermedades

La disposición exacta (secuencia) de las bases de A, C, G y T en una cadena de ADN es la receta que codifica la secuencia exacta de una proteína. Si las recetas tienen bases adicionales o mal escritas, o si se suprimen algunas, la célula puede elaborar una proteína incorrecta, o bien demasiada o demasiado poca de la correcta. Estos errores resultan muchas veces en enfermedades. En algunos casos, una sola base fuera de lugar es suficiente para provocar una enfermedad, como la anemia falciforme.

Los errores en nuestros genes, nuestro material genético, son los responsables de aproximadamente entre 3.000 y 4.000 enfermedades hereditarias, entre las que se incluyen la enfermedad de Huntington, la fibrosis quística y la distrofia muscular de Duchenne. Aún más, actualmente se sabe que las alteraciones genéticas desempeñan una función en el cáncer, en las enfermedades cardíacas, en la diabetes y en muchas otras enfermedades comunes. Los defectos genéticos aumentan el riesgo de que una persona desarrolle estos trastornos más comunes y complejos. Las enfermedades mismas son el producto de interacciones entre dichas predisposiciones genéticas y factores medioambientales, entre los que se incluyen la dieta y el estilo de vida. Algunos expertos consideran que la mitad de las personas desarrollará una enfermedad que tiene un componente genético.

La comprensión del código genético no condujo directamente a los investigadores a los genes de las enfermedades. Su capacidad para descifrar los mensajes genéticos encapsulados en el ADN se vio obstaculizado por el extraordinario número de dichos mensajes transportados en el ADN de cada célula. Una célula humana (excepto las células sexuales, de espermatozoides y óvulos, y algunas células sanguíneas que no tienen núcleo) contiene alrededor de 6 pies (1,80 m) de moléculas de ADN enroscadas estrechamente y empaquetadas dentro de 46 cromosomas, que son estructuras con forma de huso que se encuentran en el núcleo de la célula y están formadas por ADN recubierto de proteínas. Este ADN está formado por 3.000 millones de pares de bases. Si se imprimieran, esos pares de bases llenarían más de 1.000 directorios telefónicos como el de Manhattan. Sin embargo, cuando los investigadores trataron de dividir las moléculas de ADN en partes más manejables, terminaron con un caos de fragmentos aleatorios en los que se había perdido el orden del ADN original.

Los 46 cromosomas del núcleo de una célula humana guardan alrededor de 6 pies (1,80 m) de ADN, el "mapa" genético de cada individuo, en este caso un hombre como denota la designación XY. Este ADN está formado por hasta 3.000 millones de pares de bases, información suficiente para llenar más de 1.000 directorios telefónicos como el de Manhattan.

El gran avance

A finales de los años 1960, una herramienta molecular útil acudió en ayuda de estos investigadores frustrados, gracias a una serie de estudios realizados por Werner Arber en Suiza y Hamilton Smith en la Universidad Johns Hopkins. Estos investigadores estaban estudiando lo que en principio parecía ser un problema no relacionado. Ellos estaban interesados en saber cómo era posible que algunas bacterias resistiesen a la invasión de los virus. Cuando el ADN viral se introduce en estas bacterias, se corta en pequeños pedazos y se inactiva por medio de unas enzimas denominadas endonucleasas. Smith demostró que una de estas enzimas cortaba el ADN en una secuencia corta de ADN específica. El colega de Smith, Daniel Nathans, reconoció que esto proporcionaba una manera de cortar una molécula de ADN grande en fragmentos más pequeños bien definidos, y utilizó el método para generar el primer mapa físico de un cromosoma, el del virus del mono pequeño SV40. El mapa permitió a Nathans determinar la disposición de los genes individuales dentro del ADN que forma el cromosoma viral. Nathans especuló intuitivamente que los cromosomas más grandes se podrían estudiar de forma similar. Esto anunció la asignación de cromosomas, actividad que establece la base para la asignación del gen de una enfermedad a una región específica de un determinado cromosoma humano.

La enzima del corte de ADN que Smith aisló fue la primera de las más de 1.000 "enzimas de restricción" que se han descubierto en tan solo unas décadas. Las enzimas de restricción no solo permiten la asignación de cromosomas, sino que también permiten a los investigadores generar grandes cantidades de cualquier secuencia de interés específica de ADN. Normalmente estas enzimas no cortan directamente los dos filamentos de ADN, sino que cortan de manera escalonada. Por tanto, sus cortes crean colas cortas de un solo filamento en los extremos de cada fragmento, llamados extremos pegajosos. Los extremos pegajosos se pueden unir a otros filamentos de ADN con la ayuda de otro tipo de enzima, llamada ligasa. En 1973, los investigadores ya estaban usando enzimas de restricción para cortar secuencias específicas de interés del ADN y unirlas al ADN de bacterias. Las bacterias generaban entonces copias del ADN seleccionado con su propio ADN cada vez que se dividían. Como una bacteria simple crece rápidamente, produciendo más de 1.000 millones de copias de sí misma en 15 horas, se pueden producir de esta manera grandes cantidades de una secuencia específica de ADN, en un proceso denominado clonación. El ADN se puede usar para estudios adicionales o para hacer sondas de ADN.

La selección minuciosa de las secuencias genéticas indicadoras

El número abrumador de genes de la célula humana suponía un gran obstáculo para los investigadores que deseaban detectar en el ADN de una persona el gen causante de una enfermedad específica. Por ejemplo, los investigadores querían detectar el gen del tipo de hemoglobina (la proteína de la sangre que transporta el oxígeno) que se encuentra ausente en un tipo de anemia grave conocida como anemia de Cooley. Esta enfermedad puede provocar una dolencia tan debilitante, incluso la muerte en edades tempranas, que los científicos querían idear una manera de detectarla antes del nacimiento.

Con la ayuda de nuevas técnicas, los especialistas en genética determinaron que este bebé había heredado solamente uno de los genes de sus padres para la talasemia (una enfermedad hereditaria caracterizada por una anemia leve a severa) y por lo tanto no estaría afectado por este trastorno sanguíneo. (División de Servicios de Investigación, NIH).

Los investigadores habían utilizado el código genético para determinar la secuencia de ADN que codifica la serie de aminoácidos que componen parte de la proteína de la hemoglobina. Pero no tenían medios para realizar un examen aislado del ADN indicador de entre el restante ADN de los 100.000 genes de una célula humana, para poder saber si el gene era normal o no.

Una manera de evitar el problema fue descubierta en 1975 por el científico escocés Edward Southern, quien desarrolló un método eficaz para identificar una secuencia genética específica. Las enzimas restrictivas se utilizaron para cortar el ADN en fragmentos, que a continuación se separaron por tamaño tamizándolos a través de una sustancia porosa similar a la gelatina a través a la que se aplicaba una corriente eléctrica. Los fragmentos más pequeños atraviesan la gelatina más rápidamente que los más grandes, de forma que los fragmentos de ADN de distintos genes terminan en posiciones diferentes. Posteriormente, se retira la gelatina de los fragmentos separados en una hoja de papel sin cambiar sus posiciones relativas, y la copia en papel de la gelatina se sumerge en una solución que contiene moléculas de ADN radioactivas, llamadas sondas. Estas sondas son fragmentos de ADN clonados con secuencias que se igualan con una secuencia de ADN del gen objeto de interés (por ejemplo, el gen de la hemoglobina). Igualar significa que una A de un filamento de la sonda coincide con una T del filamento del gen, una G coincide con una C y así sucesivamente en distancias largas a lo largo de las dos moléculas de ADN. Esto permite que la sonda de ADN y el fragmento de ADN que está pegado al papel se emparejen, haciendo que esa región del papel sea radioactiva.

Secante de Southern. Para encontrar una mutación de un gen determinado en una muestra de ADN los científicos usan una sonda de ADN, un tramo de ADN de un solo filamento que coincide con parte del gen y se une a un átomo radioactivo. La sonda de un solo filamento busca y se une al gen. Las señales radioactivas de la sonda aparecen después en la radiografía, mostrando dónde se emparejan la sonda y el gen. (Instituto Nacional de Cáncer, NIH)

Debido a que las sondas son radioactivas en los sitios en que se unen al papel, emiten señales que se pueden ver en radiografías. Este sencillo método, llamado secante de Southern o Southern Blott en honor a su inventor, permitió a los investigadores detectar un único fragmento de ADN del gen de la hemoglobina entre más de 100.000 fragmentos en el mismo gel. Poco después de que se desarrollara el secante de Southern, los investigadores lo utilizaron para desarrollar una prueba prenatal para la anemia de Cooley y otras enfermedades poco frecuentes de las que se conocían las secuencias de ADN indicadoras.

El perfeccionamiento de la búsqueda de los genes de las enfermedades

Una observación casual realizada en 1978 por investigadores de la Universidad de California, San Francisco, resultó en el uso del secante de Southern en la detección de varios trastornos comunes más. Yuet Wai Kan y Andree-Marie Dozy estaban estudiando pacientes con anemia falciforme, una enfermedad hereditaria en la que un solo cambio en el ADN origina un defecto en la hemoglobina que provoca trombos sanguíneos dolorosos y a veces mortales. Tras utilizar una enzima restrictiva para cortar el ADN de pacientes con anemia falciforme, los investigadores observaron que la mayoría de los pacientes tenía un fragmento de ADN que contenía el gen de la hemoglobina beta con una longitud de compuesto de 13.000 pares de bases. Las personas que no padecían anemia falciforme carecían muchas veces de este fragmento de ADN tras cortar su ADN con la misma enzima. Como el tamaño del fragmento producido era diferente al que se observaba normalmente, se le llamó polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).

En sus investigaciones sobre la anemia falciforme, Yuet Wai Kan y Andree-Marie Dozy descubrieron que la enfermedad se asociaba a un gen de hemoglobina beta anormalmente largo, que posteriormente se clasificó como un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción o RFLP (de sus siglas en inglés). Los RFLPs indican otros trastornos genéticos comunes, entre los que se incluyen la enfermedad de Huntington y algunos tipos de cáncer.

Los RFLPs se han asociado a muchos trastornos genéticos comunes, entre los que se incluyen la enfermedad de Huntington y algunos tipos de cáncer. Los RFLPs permiten a los científicos utilizar el secante de Southern para detectar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad en una persona sin saber la secuencia de ADN exacta del gen que la provoca. Los RFLPs se utilizan de una segunda manera. Un RFLP que está vinculado estrechamente a una enfermedad específica (es decir, cuando las personas que padecen la enfermedad casi siempre tienen el RFLP específico) se encuentra cerca de la secuencia de ADN que alberga el gen que provoca la enfermedad. Por lo tanto, si se encuentra el sitio de corte en el ADN que creó el RFLP, se puede finalmente aislar el gen de la enfermedad en sí.

Las investigaciones de RFLPs vinculadas a trastornos específicos se pueden a veces limitar a una región específica de un cromosoma con la ayuda de la coloración de cromosomas. La coloración de cromosomas, desarrollada en los años 1970, muestra un patrón de bandas claras y oscuras que reflejan variaciones regionales en las cantidades de bases de A y T frente a bases de G y C. Con un microscopio de luz las diferencias en tamaño y patrón de las bandas distinguen los 23 pares de cromosomas el uno del otro y revelan las principales anormalidades cromosómicas, entre las que se incluyen partes de cromosomas ausentes, adicionales o situadas en lugar erróneo. Por ejemplo, el cáncer ocular llamado retinoblastoma se asocia con frecuencia a la ausencia de una banda en el cromosoma 13; este descubrimiento llevó a los investigadores a buscar RFLPs asociados con retinoblastoma dentro de esa región cromosómica.

Los investigadores también pueden rastrear un RFLP específico hasta una sección de un cromosoma determinado marcándolo con una etiqueta visible (que sea fluorescente o radioactiva). La localización del RFLP etiquetado se puede detectar una vez que se une a su secuencia complementaria de bases en un cromosoma intacto. Esta técnica se conoce como hibridación in situ.

La determinación precisa de los genes de las enfermedades

Para mejorar la precisión de las pruebas genéticas, los científicos necesitaban determinar con precisión la secuencia real de ADN de los genes causantes de enfermedades (el orden de A, C, G y T). Este esfuerzo se vio apoyado en gran medida por el desarrollo de un método para secuenciar rápidamente el ADN, realizado por investigadores de la Universidad de Harvard en 1977. Uno de los investigadores, Walter Gilbert, había estado tratando de comprender cómo se desactivaban determinados genes en bacterias (cómo se les impedía generar las proteínas que codifican) y comprendió que no avanzaría mucho a no ser que pudiese determinar la secuencia de determinados segmentos del ADN bacteriano. Junto con su colega Allan Maxam inventó un método nuevo que combinaba las sustancias químicas que cortan el ADN solamente en bases específicas con el etiquetado radioactivo y el secante de Southern para determinar rápidamente la secuencia exacta de los segmentos de ADN largos. Fred Sanger en Cambridge, Inglaterra, desarrolló al mismo tiempo un método de secuenciación de ADN diferente, pero igualmente válido.

Walter Gilbert y sus colegas de Harvard desarrollaron un método nuevo para determinar la secuencia exacta de los fragmentos de ADN largos, una técnica que hizo posible el perfeccionamiento del estudio de los genes causantes de enfermedades mucho más rápido que anteriormente. (Cortesía de Harvard News Office.)

A principios de los años 80, los métodos de Maxam-Gilbert y Sanger para la secuenciación de ADN se mejoraron y automatizaron para acelerar el proceso. La determinación de los genes causantes de enfermedades podría proseguir relativamente rápido. Mediante una técnica llamada clonación posicional, los investigadores se centraron primero en el cromosoma con mayor probabilidad de albergar un gen de enfermedad, mediante la coloración de cromosomas, la hibridación in situ u otras técnicas. Una vez identificado el cromosoma que albergaba el gen de la enfermedad, buscaron los RFLPs u otros marcadores genéticos en esa ubicación vinculados estrechamente a la enfermedad. A continuación, determinan la secuencia de las bases de ADN en la región de los marcadores indicadores. Saben que su búsqueda ha terminado si determinan con exactitud una secuencia de ADN que se encuentra solamente en las personas con la enfermedad en cuestión. La clonación posicional se ha utilizado hasta ahora para descubrir más de 50 genes causantes de enfermedades, entre los que se incluyen los genes de la fibrosis quística, la distrofia muscular de Duchenne, algunos tipos de enfermedad Alzheimer y cáncer de mama temprano.