Nesse período, os imperadores buscaram combater o helenismo, predominando as instituições latinas. O latim também foi mantido como língua oficial.

O Império Bizantino, 1265. The Historical Atlas, William R. Shepherd, 1911.

De 395 a 457, estendeu-se a dinastia Teodosiana, cujo primeiro imperador foi Arcádio, responsável pela expulsão dos visigodos no final do século IV. Destacou-se também o cerco de Átila, o Huno, afastado, em 443, por meio do pagamento de um resgate de seis mil libras de ouro.

De 457 a 518, estendeu-se a dinastia Leonina que foi deposta em 477 mais somente o Imperador Basilisco ou (Biznico) e foi restaurada em 491 por Anastácio I um de seus herdeiros, na qual destacou-se, em 488, o acordo de combate aos hérulos levado a efeito entre o imperador Zenão I e o rei dos ostrogodos, Teodorico.

A mais importante dinastia latina foi a Justiniana (518-610). Nela, o imperador Justiniano I (527-565) buscou restaurar e dispor sob sua inteira autoridade a vastidão típica do Império dos Antoninos (96-192). Em 534, sob o comando do general Belisário, o exército de Justiniano conquistou o Reino dos Vndalos. Em 554, com a conclusão das Guerras Góticas, na Península Itálica, o Império abraçava também o Reino dos Ostrogodos.

Para a posteridade, porém, o maior legado desse período foi o Corpus Juris Civili, base, ainda hoje, da maioria dos códigos legislativos do mundo. O Corpus Juris Civili era dividido em quatro partes: o Código Justiniano - compilação de todas as leis romanas desde Adriano (117-138) -, o Digesto ou Pandectas - reunião de trabalhos de jurisprudência de grandes juristas -, as Institutas - espécie de manual que facilitava o uso do Código ou do Digesto -, e as Novelas ou Autênticas - novas leis decretadas por Justiniano e seus sucessores.

Justiniano ordenou também a construção da Basílica de Santa Sofia, com estilo arquitetônico próprio, o qual convencionou-se chamar de estilo bizantino.

No século VI, para combater a heresia do nestorianismo, o Patriarca de Alexandria, Dióscoro, desenvolveu o monofisismo, formulação teológica também condenada pela Igreja Católica e muito ligada a ideiais de emancipação política no Egito e na Síria. Desencadearam-se então movimentos de perseguição aos monofisistas, protegidos, no entanto, pela esposa de Justiniano, a Imperatriz Teodora. Buscando manter a unidade do Império, Justiniano desenvolveu a heresia do monotelismo, uma tentativa de conciliação entre o monofisismo e o nestorianismo.

O cesaropapismo de Justiniano, que inclusive muito marcou o Império Bizantino, gerava distúrbios na ordem e insatisfação da população, já indignada com a cobrança abusiva de impostos. Em 532, estourava a Revolta de Nika, sufocada completamente pelo general Belisário após oito dias.

Justiniano ainda se viu às voltas com terremotos, fome e a grande peste de 544. Após sua morte, os lombardos, até então estabelecidos na Panônia como aliados, invadiram, em 568, a Itália setentrional. Os bizantinos mantiveram ainda o Exarcado de Ravenna, os ducados de Roma e Nápoles, a Ístria, a Itália Meridional e a Sicília.

Os Justinianos ainda enfrentaram as investidas do Império Persa Sassnida, no Oriente, e dos ávaros, no norte. Para tanto, deixaram para segundo plano a proteção dos territórios conquistados na Hispnia, no norte da África e na Itália, o que facilitou a posterior fixação, nestas regiões, dos maometanos e dos Estados da Igreja.