Figlio unico di un calzolaio e di una sarta, "Pippo", come lo hanno sempre chiamato amici, colleghi e fan, passa la giovinezza a Milano e viene educato in un seminario dei Gesuiti, meditando per qualche tempo di avvicinarsi al sacerdozio. Successivamente, grazie all'amico melomane  Danilo Fois che, pur non interessato, lo trascina per ore ed ore al loggione della Scala, inizia a dedicarsi al canto, formandosi in modo frammentario presso vari maestri (tra i quali il baritono Luigi Montesanto), le cui lezioni vengono pagate da Fois e da altri amici. Allo scoppio della guerra viene arruolato nell'esercito, finendo ripetutamente in cella per il suo comportamento. Grazie ad un ufficiale medico che lo giudicò "più utile all'Italia come cantante che come soldato",  ottiene una licenza per una convalescenza fittizia poche ore prima della partenza per il fronte. Inizia quindi un'attività come cantante di musica leggera ed avanspettacolo con lo pseudonimo di Nino Florio. Fuggito in Svizzera nell'ultimo periodo della guerra, ha l'opportunità di esibirsi presso la radio di Losanna, alternando musica lirica e leggera. Tornato a Milano dopo il termine del conflitto, riprende le lezioni di canto e, dopo alcuni piccoli ruoli, debutta ufficialmente il 20 aprile 1946 a Reggio Emilia nel ruolo di Des Grieux della Manon di Massenet, iniziando rapidamente un'intensa attività in teatri di provincia ed anche in sedi più importanti, come Genova, Bologna, Venezia. Nello stesso anno, bruciando le tappe, inizia inoltre la carriera internazionale inaugurando la stagione del Gran Teatre del Liceu di Barcellona, ancora con Manon. Con il medesimo ruolo, il 15 marzo del 1947 debutta alla Scala, mentre il 25 febbraio del 1948, come Duca di Mantova nel Rigoletto, è la volta del Metropolitan di New York, nel quale sarà una presenza fissa fino al 1952. Nel 1951, con La traviata a San Paolo del Brasile, inizia il legame artistico con Maria Callas. Oltre che nei principali teatri italiani ed in particolare alla Scala, dove, dopo il soggiorno al Met e tournèe in Centro e Sudamerica, fa ritorno per il Natale 1952  con Callas) e dove apparirà regolarmente fino a tutti gli anni cinquanta, la carriera si sviluppa in tutti gli altri più importanti teatri del mondo.Tappe fondamentali, rimaste nella storia dell'opera, sono alcune rappresentazioni alla Scala, tra le quali Lucia di Lammermoor nel 1954, con Callas , Carmen nel 1955, con Giulietta Simionato , Traviata, nello stesso anno, sempre con Callas, nella storica edizione con la regia di Luchino Visconti e Tosca nel 1958, in occasione del rientro alla Scala dopo diversi anni di Renata Tebaldi. Dalla seconda metà degli anni sessanta inizia a sfoltire progressivamente gli impegni operistici, privilegiando recital e concerti, dedicandosi anche all'insegnamento e tenendo seminari e stage di canto; ottiene inoltre un grande successo in Germania come interprete di operetta. Nel 1973 è ancora una volta partner di Maria Callas nella sua ultima tournée mondiale, che ha un eccezionale successo di pubblico, ma che si interrompe poi bruscamente. Nel 1975 tiene un master a Spoleto per i vincitori del Concorso Nazionale di canto "Adriano Belli". Appare per l'ultima volta in una rappresentazione operistica nel 1992 alle Terme di Caracalla, quale imperatore Altoum nella Turandot. Negli anni '90 nasce a Trapani, nell'ambito del Luglio musicale trapanese il “Concorso Internazionale Giuseppe Di Stefano. I Giovani e l’Opera”, che Di Stefano segue per qualche tempo. Il 3 dicembre 2004 rimane gravemente ferito nel tentativo di difendere il suo cane durante un'aggressione da parte di alcuni rapinatori, mentre con la moglie, il soprano Monika Curth, si trova nella sua casa di Diani in Kenya; ricoverato all'ospedale di Mombasa, le sue condizioni si rivelano più gravi di quanto fossero apparse in un primo momento. In seguito alle ferite riportate il 7 dicembre entra in coma e il 23 dicembre, dopo un lungo viaggio di trasferimento verso l'Italia, viene ricoverato in un ospedale milanese. Non si riprende mai del tutto, restando infermo sino alla morte, avvenuta nella sua casa di Santa Maria Hoè, presso Lecco, il 3 marzo 2008. Di Stefano è stato uno dei cantanti lirici più popolari e amati del dopoguerra. Il suo nome è anche legato in maniera indissolubile al sodalizio artistico ed affettivo con Maria Callas. Luciano Pavarotti aveva per lui una grande ammirazione e una volta raccontò: "Il mio idolo è Giuseppe Di Stefano; lo amai ancor più di Beniamino Gigli e questo mi costò addirittura, per l'unica volta in vita mia, uno schiaffo da mio padre, che continuò a preferirgli Gigli".